Proteine modulari per lo studio dei trascritti cellulari

Il controllo e il monitoraggio dell’RNA sono strumenti estremamente utili nello studio dell’espressione genica. A tal proposito, un gruppo di ricercatori del MIT (Massachussets Institute of Technology) ha messo a punto un innovativo sistema basato su proteine modulari capaci di legarsi all’mRNA in modo altamente specifico e senza modificarne la sequenza. Uno dei metodi maggiormente utilizzati oggi consiste nel sistema MS2, basato sull’omonimo batteriofago, che sfrutta l’elevata affinità di interazione tra la capsula proteica, MCP (MS2 CoatProtein) e il suo relativo sito di attacco all’RNA, MBS (MS2 Binding Site). L’mRNA di interesse viene modificato inserendo una sequenza esogena in modo da esprimere i motivi tipici riconosciuti dall’MCP, la quale, a sua volta, è fusa con una GFP (Green Fluorescent Protein): il costrutto MS2-GFP, riconoscendo le ripetizioni MS2, rimane associato all’mRNA reporter nel citoplasma, permettendone la visualizzazione in vivo mediante osservazione al microscopio a epifluorescenza o al microscopio confocale. Questo metodo è stato utilizzato in cellule di lievito (Bertrand et al. 1998) e, più di recente, in cellule di topo (Park et al., 2014).

Per quanto riguarda il targeting di mRNA in cellule di mammifero gli studi maggiori sono stati compiuti sulla proteina umana PumHD, coinvolta nella regolazione della traduzione genica nello sviluppo embrionale. PumHD è formata da 10 unità di cui 8 in grado di legarsi a una precisa sequenza di RNA (3’-AUAUAUGU-5’) chiamata Nano Response Element (NRE), la quale funge da sito di legame per i fattori di trascrizione. PumHD modificati possono legarsi a sequenze diverse rispetto alla NRE, evidenziando come la modularità di queste proteine giochi un ruolo chiave nel suddetto legame.

Nel loro studio, i ricercatori del MIT hanno utilizzato proteine PumHD modificate e testando diverse combinazioni amminoacidiche fino a trovare un particolare set di quattro moduli proteici, uno per ogni nucleotide possibile nell’RNA, riuscendo così a legare sequenze con lunghezza variabile tra le 6 e le 18 basi. Questi moduli, che sono stati denominati Pumby (Pumilio Based Assembly), possono essere uniti tra loro in catene di varia composizione e lunghezza e legarsi così a RNA target con un’elevata specificità (bastano 3 mis-match per evitare il legame):  conoscendo la sequenza nucleotidica dell’mRNA di interesse, è possibile costruire la corrispettiva binding-protein  unendo i moduli tra loro.

I ricercatori sono riusciti a determinare la frequenza di traduzione, mediante un saggio di implementazione GFP-split: una proteina PumHD variabile (Pum1) e una wild type (Pum2), in grado di legarsi a due sequenze adiacenti poste a monte del codone di stop dell’mRNA che codifica per una proteina segnale (mRuby),  vengono fuse con un frammento di GFP; nel momento in cui tali proteine di fusione si legano al sito, la GFP viene ricostituita emettendo così un segnale fluorescente rilevabile.

È stata inoltre testata la possibilità di stimolare la traduzione grazie al legame tra la proteina PumHD con un iniziatore di traduzione (eIF4E): è stato creato un trascritto contenente, nell’ordine, una sequenza Kozak, che regola la traduzione della luciferasi di lucciola, un ORF della luciferasi di lucciola (Firefly) e un ORF della luciferasi di renilla (Renilla). La sequenza Kozak promuove la traduzione di Firefly (in quanto quest’ultima posta immediatamente a valle della sequenza stessa), mentre ha effetti trascurabili su Renilla; inoltre, tra le due ORF era presente una sequenza target per PumHD alla quale i ricercatori hanno consentito il legame con la proteina di fusione PumHD-eIF4E osservando così una maggior traduzione di Renilla. In tal caso la luciferasi di lucciola è stata utilizzata come controllo, essendo essa posizionata a monte rispetto alla sequenza target per PumHD.

Le tecniche testate in questo studio sono potenzialmente utili per aumentare o diminuire la sintesi proteica senza modificare le sequenze codificanti. Proprio grazie alla modularità del sistema Pumby si potrebbero ingegnerizzare costrutti formati da una successione di diversi enzimi che vadano a stimolare l’espressione di un particolare prodotto genico per la produzione di farmaci o qualsiasi altra molecola di interesse. Risulta chiaro, dunque, come questo sistema sia utile per studi di misurazione e manipolazione di RNA in cellule viventi.

L’articolo originale è stato pubblicato in data 26 Aprile sulla prestigiosa rivista statunitense PNAS (Proceedings of the National Academy of Sciences).
http://m.pnas.org/content/113/19/E2579.abstract

Testo a cura di: Irene Aiello e Stefano Bertacchi
Editor: Stefano Bertacchi

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